糖原磷酸化酶 a(GPa)活性检测试剂盒

　　糖原磷酸化酶 a(GPa)活性检测试剂盒

　　微量法

　　规格：100T/96S

　　产品内容：使用请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

　　试剂名称 规格 保存条件

　　提取液 液体 110mL×1 瓶 2-8℃保存

　　试剂一 液体 20mL×1 瓶 2-8℃保存

　　试剂二 粉剂×1 支 2-8℃保存

　　试剂三 粉剂×1 支 2-8℃保存

　　试剂四 粉剂×1 支 -20℃保存

　　试剂五 粉剂×2 支 -20℃保存

　　试剂六 粉剂×2 支 -20℃保存

　　溶液的配制：

　　1、 试剂二：临用加入 0.5 mL 蒸馏水，充分混匀;

　　2、 试剂三：临用加入 0.5 mL 蒸馏水，充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融;

　　3、 试剂四：临用加入 1.25 mL 蒸馏水，充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融;

　　4、 试剂五：临用取一支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融;1 瓶粉剂即可做 100T，为延长使用时间，故多给一支。

　　5、 试剂六：临用取一支加入 1 mL 蒸馏水，充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周，避免反复冻融;1 瓶粉剂即可做 100T，为延长使用时间，故多给一支。

　　6、 工作液的配制：临用根据实验所需用量，按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：蒸馏水=148μL:4μL: 4μL: 4μL: 10μL(1T 的量)的比例，充分混匀，现用现配。

　　产品说明：

　　糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶，催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶 a

　　(Glycogen phosphorylase a, GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(Glycogen phosphorylase b, GPb)两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下进行。未添加激活剂时，糖原磷酸化酶 a 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。

　　注意：实验之建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

　　需自备的仪器和用品：

　　紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、冰和蒸馏水。

　　操作步骤：

　　一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

　　1、组织：按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆，然后 8000 g，4℃，离心 10 min，取上清置于冰上待测。

　　2、细菌或者细胞：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

　　3、血清(浆)：直接检测

　　二、测定步骤

　　1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至 340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

　　2、 临用工作液置于 37℃预热 5min。

　　3、 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 样本、10 μL 试剂五、10 μL 试剂六、170 μL 工作液，充分混匀 10s，记录 340nm 处 10s 时吸光值 A1，37℃水浴锅或者恒温培养箱反应 10min(酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃)，反应后拿出迅速擦干测定 10min10s 时吸光值 A2。计算 ΔA=A2-A1。

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